【R语言】——基因GO/KEGG富集分析!超级简单的保姆级教程!
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上期“干货预警——原来基因功能富集分析这么简单!”和“【R语言】——基因GO/KEGG功能富集结果可视化(保姆级教程)”介绍如何使用DAVID在线分析工具对基因进行GO/KEGG功能富集分析和使用R ggplot包对获得的基因GO/KEGG功能富集结果进行可视化。本期介绍使用R clusterProfiler包和R AnnotationHub包对基因进行GO/KEGG功能富集分析、OrgDb包制作以及结果可视化。
GO/KEGG功能富集分析中重要的是背景基因的选择,使用R clusterProfiler包对基因进行富集,需要导入目的基因(前景基因)相对应物种的参考基因组(背景基因),现阶段“bioconductor”已有十几种常见动物,如人类、小鼠等物种的OrgDb。但仍然有许多物种不在Bioconductor的OrgDb列表里,但存在参考基因组,如山羊,绵羊等,这种情况则需要用到R AnnotationHub包进行索引其对应物种的参考基因组,并制作OrgDb包使用。
1 数据准备
数据输入格式(xlsx格式):
2 R包加载、数据导入及处理
- #下载包#
- if(!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))
- install.packages("BiocManager")
- BiocManager::install("clusterProfiler")
- BiocManager::install("topGO")
- BiocManager::install("Rgraphviz")
- BiocManager::install("pathview")
- install.packages("ggplot2")
- BiocManager::install('stringr')
- install.packages("openxlsx")
- #加载包#
- library(clusterProfiler)
- library(topGO)
- library(Rgraphviz)
- library(pathview)
- library(ggplot2)
- library(stringr)
- library(openxlsx)
- #导入数据#
- remove(list = ls()) #清除 Global Environment
- getwd() #查看当前工作路径
- setwd("C:/Rdata/jc") #设置需要的工作路径
- list.files() #查看当前工作目录下的文件
- data = read.xlsx("enrich-gene.xlsx",sheet= "enrich_genes",sep=',') #导入数据
- head(data)
- #数据处理-差异基因筛选#
- vector = abs(data$log2FC) > 1 & data$PValue < 0.05 & data$gene_name !="" ##abs绝对值;通常logFC> 1和PValue< 0.05条件进行筛选;data$gene_name != ""表示gene_name不为空白
- #data$gene_name<-str_to_title(data$gene_name)#用stringr将基因名称的第一个字母大写(小鼠首字母为大写)
- data_sgni= data[vector,]#筛选差异基因
- head(data_sgni)
- #All_gene <- rownames(data) # 提取所有基因基因名
3 背景基因选择及GO/KEGG富集分析
3.1 在“bioconductor”中已有OrgDb的物种的富集分析
在http://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#___OrgDb 中寻找需要物种的OrgDb(目前仅有下图所示物种),以人类“org.Hs.eg.db”为例:
图1 “bioconductor”中已有OrgDb的物种
- #已有OrgDb的常见物种#
- BiocManager::install("org.Hs.eg.db")
- library(org.Hs.eg.db)
- #基因ID转换#
- keytypes(org.Hs.eg.db) #查看所有可转化类型
- entrezid_all = mapIds(x = org.Hs.eg.db, #id转换的比对基因组(背景基因)的物种,以人为例
- keys = data_sgni$gene_name, #将输入的gene_name列进行数据转换
- keytype = "SYMBOL", #输入数据的类型
- column = "ENTREZID")#输出数据的类型
- entrezid_all = na.omit(entrezid_all) #na省略entrezid_all中不是一一对应的数据情况
- entrezid_all = data.frame(entrezid_all) #将entrezid_all变成数据框格式
- head(entrezid_all)
- ###GO富集分析###
- GO_enrich = enrichGO(gene = entrezid_all[,1], #表示前景基因,即待富集的基因列表;[,1]表示对entrezid_all数据集的第1列进行处理
- OrgDb = org.Hs.eg.db,
- keyType = "ENTREZID", #输入数据的类型
- ont = "ALL", #可以输入CC/MF/BP/ALL
- #universe = 背景数据集 # 表示背景基因,无参的物种选择组装出来的全部unigenes作为背景基因;有参背景基因则不需要。
- pvalueCutoff = 1,qvalueCutoff = 1, #表示筛选的阈值,阈值设置太严格可导致筛选不到基因。可指定 1 以输出全部
- readable = T) #是否将基因ID映射到基因名称。
- GO_enrich = data.frame(GO_enrich) #将GO_enrich导成数据框格式
- #数据导出#
- write.csv(GO_enrich,'C:/Rdata/保存文件/GO_enrich.csv')
- ###KEGG富集分析###
- KEGG_enrich = enrichKEGG(gene = entrezid_all[,1], #即待富集的基因列表
- keyType = "kegg",
- pAdjustMethod = 'fdr', #指定p值校正方法
- organism= "human", #hsa,可根据你自己要研究的物种更改,可在https://www.kegg.jp/brite/br08611中寻找
- qvalueCutoff = 1, #指定 p 值阈值(可指定 1 以输出全部)
- pvalueCutoff=1) #指定 q 值阈值(可指定 1 以输出全部)
- KEGG_enrich = data.frame(KEGG_enrich)
- write.csv(KEGG_enrich,'C:/Rdata/保存文件/KEGG_enrich.csv') #数据导出
3.2 使用“AnnotationHub”获取在线注释并创建OrgDb对象
如果你所研究的物种不在Bioconductor的OrgDb列表里,但存在参考基因组,如山羊(Capra hircus/goat/chx),绵羊(sheet/Ovis aries)等,这种情况则需要用到AnnotationHub函数进行索引其对应物种的参考基因组(背景基因),并制作OrgDb包使用。
注意:AnnotationHub包连接的Bioconductor数据库是实时更新的,所以需要用到的时候再在线查询和使用。
- ###制作可索引到物种的OrgDb包###
- #下载和加载包#
- BiocManager::install("AnnotationHub")
- BiocManager::install("AnnotationDbi")
- BiocManager::install("rtracklayer")
- library(AnnotationHub)
- library(AnnotationDbi)
- library(rtracklayer)
- #索引与制作OrgDb#
- hub <- AnnotationHub() #建立AnnotationHub对象保存到hub
- query(hub, 'Capra hircus') #查询包含山羊(Capra hircus)的物种信息;结果有物种的各类信息需要进一步筛选
- query(hub[hub$rdataclass == "OrgDb"] , "Capra hircus") #筛选我们需要OrgDb类型;也可将上一步与这一步合并成query(hub,'org.Capra hircus')进行搜索
- goat <- hub[['AH101444']] #制作Capra hircus的OrgDb库;AH101444是Capra hircus对应的编号。
- goat #查看goat
- #help('select')
- #保存、载入与查看-AnnotationDbi#
- saveDb(goat,file="goat.OrgDb") #把goat对象保存成goat.OrgDb文件
- goat = loadDb(file="goat.OrgDb") #载入goat.OrgDb文件,保存到goat
- length(keys(goat)) #查看包含的基因数量
- columns(goat) #查看goat的数据类型
- keys(goat, keytype = "SYMBOL") #查看SYMBOL数据集下的ID
- # 查看AnnotationHub内容——根据自己兴趣了解#
- #display(hub) #调出网页
- #unique(hub$species) #查看hub里包含的所有物种
- #unique(hub$rdataclass) #查看hub里的数据类型
- #hub[hub$rdataclass == "OrgDb"] #查看hub里OrgDb类型的数据
- #基因ID转换#
- keytypes(goat) #查看所有可转化类型
- entrezid_all = mapIds(x = goat, #id转换的比对基因组(背景基因)所属物种,这边为山羊
- keys = data_sgni$gene_name, #将输入的gene_name列进行数据转换
- keytype = "SYMBOL", #输入数据的类型
- column = "ENTREZID")#输出数据的类型
- entrezid_all = na.omit(entrezid_all) #na省略entrezid_all中不是一一对应的数据情况
- entrezid_all = data.frame(entrezid_all) #将entrezid_all变成数据框格式
- head(entrezid_all)
- #GO富集分析#
- GO_enrich = enrichGO(gene = entrezid_all[,1], #待富集的基因列表
- OrgDb = goat, #指定物种的基因数据库,goat直接赋值给OrgDb参数即可
- keyType = 'ENTREZID', #输入数据的类型
- ont = 'ALL', #可指定 BP\MF\CC\ALL
- pAdjustMethod = 'fdr', #指定 p 值校正方法
- pvalueCutoff = 1, #指定 p 值阈值(指定 1 以输出全部)
- qvalueCutoff = 1, #指定 q 值阈值(指定 1 以输出全部)
- readable = FALSE)
- GO_enrich = data.frame(GO_enrich)
- write.csv(GO_enrich,'C:/Rdata/保存文件/GO_enrich.csv') #数据导出#
- ###KEGG富集分析###
- KEGG_enrich = enrichKEGG(gene = entrezid_all[,1], #即待富集的基因列表
- keyType = "kegg",
- pAdjustMethod = 'fdr', #指定p值校正方法
- organism= "chx", #山羊,可根据你自己要研究的物种更改,可在https://www.kegg.jp/brite/br08611中寻找
- qvalueCutoff = 1, #指定 p 值阈值(可指定 1 以输出全部)
- pvalueCutoff=1) #指定 q 值阈值(可指定 1 以输出全部)
- KEGG_enrich = data.frame(KEGG_enrich)
- write.csv(KEGG_enrich,'C:/Rdata/保存文件/KEGG_enrich.csv') #数据导出
输出的GO/KEGG富集结果各列内容:
ONTOLOGY:GO的BP(生物学过程)、CC(细胞组分)或MF(分子功能)三个方面内容;
ID:富集到的GO term/KEGG term;
Description:对GO term/KEGG term的生物学功能和意义进行描述;
GeneRatio:富集到该GO term/KEGG term中的基因数目/给定基因的总数目;
BgRatio:该GO term/KEGG term中背景基因总数目/该物种所有已知GO功能基因的数目;
pvalue、p.adjust和qvalue:p值、校正后p值和q值;
geneID和Count:富集到该GO term/KEGG term中的基因名称和数目。
4 GO/KEGG富集结果可视化
- ###GO/KEGG富集结果可视化###
- #数据载入与处理#
- install.packages("ggplot2")
- library(ggplot2)
- go_enrich = read.xlsx("enrich-gene.xlsx",sheet= "ONTOLOGY",sep=',')
- go_enrich$term <- paste(go_enrich$ID, go_enrich$Description, sep = ': ') #将ID与Description合并成新的一列
- go_enrich$term <- factor(go_enrich$term, levels = go_enrich$term,ordered = T)
- #纵向柱状图#
- ggplot(go_enrich,
- aes(x=term,y=Count, fill=ONTOLOGY)) + #x、y轴定义;根据ONTOLOGY填充颜色
- geom_bar(stat="identity", width=0.8) + #柱状图宽度
- scale_fill_manual(values = c("#6666FF", "#33CC33", "#FF6666") ) + #柱状图填充颜色
- facet_grid(ONTOLOGY~., scale = 'free_y', space = 'free_y')+
- coord_flip() + #让柱状图变为纵向
- xlab("GO term") + #x轴标签
- ylab("Gene_Number") + #y轴标签
- labs(title = "GO Terms Enrich")+ #设置标题
- theme_bw()
- #help(theme) #查阅这个函数其他具体格式
- #横向柱状图#
- ggplot(go_enrich,
- aes(x=term,y=Count, fill=ONTOLOGY)) + #x、y轴定义;根据ONTOLOGY填充颜色
- geom_bar(stat="identity", width=0.8) + #柱状图宽度
- scale_fill_manual(values = c("#6666FF", "#33CC33", "#FF6666") ) + #柱状图填充颜色
- facet_grid(.~ONTOLOGY, scale = 'free_x', space = 'free_x')+
- xlab("GO term") + #x轴标签
- ylab("Gene_Number") + #y轴标签
- labs(title = "GO Terms Enrich")+ #设置标题
- theme_bw() +
- theme(axis.text.x=element_text(family="sans",face = "bold", color="gray50",angle = 70,vjust = 1, hjust = 1 )) #对字体样式、颜色、还有横坐标角度()
- #气泡图#
- ggplot(go_enrich,
- aes(y=term,x=Count))+
- geom_point(aes(size=Count,color=p.adjust))+
- facet_grid(ONTOLOGY~., scale = 'free_y', space = 'free_y')+
- scale_color_gradient(low = "red",high ="blue")+
- labs(color=expression(PValue,size="Count"),
- x="Gene Ratio",y="GO term",title="GO Enrichment")+
- theme_bw()
图1 为GO富集结果图
KEGG富集结果与GO富集结果可视化类似可参考上一期“【R语言】——基因GO/KEGG功能富集结果可视化(保姆级教程)”内容。
好了本次分享就到这里,下期有更精彩内容,敬请期待。
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